Le Chevalier Brun (Le guerrier de la lumière)

Rôle de la Semaphorine 3E (sema3E) dans le système nerveux central

Abstract

De nouvelles protéines impliquées dans le guidage à distance des cônes de croissance axonal ont été isolées et certains de leurs récepteurs récemment mis à jour. Il s'agit des molécules de la famille des Sémaphorines comme les « Sema3E » et les récepteurs Plexin D1 et Npn1 (Bartoe et autres 2006, Falk et autres 2005).. Nous vérifions In vitro sur des cultures primaires de neurones dissociés la présence d'une attraction ou d'une répulsion dans le développement du système nerveux central sur des sections de cerveau «cortex limbique et subiculum » des souris E17. En employant des approches génétiques et cellulaires. On utilise des constructions de protéine de chimère de Sema3E et de la phosphatase-alcaline (Sema3E-AP) pour observer leurs projections axonal. Et nous vérifierons aussi l'effet d'inhibiteur sur la voix du Pi3K. Et utilisant la technique de transfection sur des cellules COS T75 avec des : vecteur vide, PlexinD1, Npn1 ou les deux. Suite aux résultats trouver on suggérer le complexe sema3E/Plexin3E conduit à 'une répulsion dans la région de cortex et une attraction dans le subiculum effet d'une cascade de phosphorylation qui fin par activer ou inhiber la déstabilisation de cytosquelette.

Mots clés : Séma3E, Plexin D1, cortex, subiculum.

Introduction :

Une question importante à laquelle les embryologistes sont confrontés est de parvenir à suivre le développement de telle ou telle structure au cours du développement. Il est en effet crucial de connaître l'origine des précurseurs d'un tissu pour pouvoir les suivre au cours du temps et comprendre les interactions/inductions auxquelles ils sont soumis au cours de l'embryogenèse.

Récemment on a montré que pendant le développement, les mutants des souris Sema3E et la Plexin D1 présentent des phénotypes semblables, et aussi que la Sema3E est exprimée dans la région des somites directement à cote de la région intersomitique où elle est exprimée la Plexin D1. Ce qui suggère une relation de répulsion entre la Sema3E et la Plexin D1 (Gu et autres 2005).

Cependant les rôles des complexes PlexinD1-Sema3E demeurent mal connus particulièrement dans le système nerveux. Donc avec des approches génétiques et cellulaires on va étudier quelle est le rôle du Sema3E sur des sections de cerveau «cortex limbique et subiculum » des souris E17. Et l'effet des liaisons de Sema3E sur les molécules PlexinD1 et Npn1. En fin, Mise en évidence la phosphorylation d'Akt suite à la stimulation par Sema3E sur des neurones du subiculum et du cortex.

Matériel et méthodes :

Préparation des cellules :

Après avoir sacrifié des souris enceintes au stade E17.5 et récupérer les embryons, on dissèque les cerveaux en prenant les cortex limbique et les subiculum (mettre les tissus, chaque types appart, dans le même tube), afin de préparer des cultures primaires de neurones du cortex et du subiculum. En parallèle, on préparer une boite 4 puits ensemencés avec 10 000 dans 2 puits et 20 000 cellules dans 2 autres puits et une boite de 3 cm ensemencée avec 2 millions de cellules (le comptage se fait sur cellule de Malassez).

Première manipulation :

Objectif : Déterminer effet de Sema3E sur la croissance des axones des neurones du subiculum et du cortex.

Dans les boites de cultures de neurones de 3cm, ajouter un inhibiteur de la voie Pi3K (LY : 20μM, soit 4μl à 10mM), attendre 2h. Stimulation ou pas 10 min avec 10mM de Sema3E-AP, Lyse (avec le tampon de lyse), dosage protéique, Electrophorèse, Transfert, Saturation et on ajoute le 1^er Anticorps anti-phosphoAkt lapin 1/500 dilué dans PBST avec 5% lait, pour une tout la nuit à 4 °C. On rajoute l'anticorps secondaire anti-lapin conjugué avec HRP 1/7000 dilué dans PBST avec 1% lait (HRP: Horse Radish Peroxidase); on réalise la même expérience avec une anti-actine, anti-tubuline et aussi avec un anti-GSK3. puis on réalise la révélation des Western blot en fin on mesure l'intensité avec le programme Image J.

Pour l'immunofluorescence on choisi un puit avec sema 3E et un autre sans sema 3E des boite à 4 puits. On ajoute 5OO μl de 4% PFA dilue dans PBS et lave avec PBS X1 et on perméabilise avec 0.1% triton dans PBS 1X puis on bloque avec 5OO μl de la solution de blocage. Incuber pendant toute la nuit à 4°C avec 250μl d'anti-phosphoneurofilament SMI31 (un neuro-marquer), ensuite avec 250μl de Cy3-conjugue avec un anticorps anti-souris pendant 50 min dans le noir. Puis on observe sous microscope à fluorescence verte. On prend des photographies et on mesure la croissance axonale à l'aide du programme ImageJ.

Deuxième manipulation :

Objectif : Etudier la liaison de Sema3E sur les molécules PlexinD1 et Npn1

Préparation de boites de cellules COS, à partir d'une boite de cellules COS T75, préparer une boite 4 puits ensemencées avec 40 000 cellules par puits et une boite de 6 puits ensemencée avec 2.10⁵ cellules par puits. Transfection des cellules COS avec rien, vecteur vide, PlexinD1, Npn1 ou les deux pour lyse et révélation.

Pour mesurer la liaison, utiliser les boites de 6cm, on lyse les cellules dans 200ul de tampon de lyse (10mM Tris HCl pH 8, 1% triton). Apres centrifugation et récupération de surnageant et on prendre 100μl pour mesurer l'activité phosphatase alkaline, afin mesurer la quantité de Sema3E fixée, en mesurant la pente pour chaque boite.

Pour révéler la liaison in situ de la sema3E-AP (binding), utiliser les boites 4 puits. On fixe les cellules pendant 30s dans le tampon de fixation. Apres rincer avec du milieu de révélation et lancer la révélation en diluant mille fois la solution de NBT et de BCIP (substrat de l'enzyme). On arrêter les réactions en même temps, avec du PBS et on prendre des photos. En fin on mesure l'intensité de Binding à l'aide du programme ImageJ.

Résultats :

Le Western blot : Suite au calcule des moyennes et des rapports d'intensités on a peu établir le tableau suivant :

L'immunofluorescence : Après analyse et synthèse des résultats de la croissance axonale avec le programme Image J, les résultats généraux sont représente dans l'histogramme suivant :

La mesurer de l'intensité de la liaison (binding) :

Pour les contrôle : avec sema3E, avec AP et vecteur vide sont résume dans le tableau suivant :

Pour les expériences :

Discussion :

D'après les résultats du Western blot. On remarque dans le cortex, après comparaison entre les résultats avec sema3E et ceux sans sema3E, une nette diminution de l'intensité suite a l'ajoute de sema3E. Donc une activation de la phosphorylation des molécules (Akt, GSK3) qui font partie de la cascade de la réponse intracellulaire conséquence à la liaison de sema3E sur son récepteur conduisant la déstabilisation du cytosquelette. Alors que dans le subiculum une augmentions de l'intensité donc une inhibition de la phosphorylation et l'arrêt de la cascade.

Cela explique les résultats de l'immunofluorescence, une diminution de la pousser axonale dans le cortex en présence de la sema3E (environ moins 10,87%). Ce qui laisse suggérer l'existence d'une répulsion dans la région de cortex et une attraction dans le subiculum.

Les expériences avec les cellules COS et la mesurer de l'intensité de la liaison (binding) avec la Plexin D1 et la Npn1. Montre que la sema3E se lié avec la Plexin D1. Car on remarque une augmentation de l'intensité avec la Plexin D1 (de 50,41%) par rapport au contrôle sema3E seule. Alors qu'avec la Npn 1 on ne constate aucune variation représentative.

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